Приказ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161

"О совершенствовании серологической диагностики сифилиса" (вместе с "Инструкцией по постановке серологических реакций на сифилис")
Редакция от 02.09.1985 — Документ утратил силу, см. «Приказ Минздрава РФ от 26.03.2001 N 87»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ПРИКАЗ
от 2 сентября 1985 г. N 1161

О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

В целях дальнейшего совершенствования диагностики сифилиса:

I. Утверждаю: Инструкцию по постановке серологических реакций на сифилис.

II. Приказываю:

1. Министрам здравоохранения союзных республик ввести в действие с 1 января 1986 года прилагаемую Инструкцию. Размножить настоящую Инструкцию в необходимых количествах и довести ее до исполнителей.

2. Считать утратившей силу Инструкцию но постановке серологических реакций на сифилис, утвержденную приказом Министра здравоохранения СССР от 27 февраля 1963 года N 86.

3. Контроль за выполнением приказа возложить на заместителя Министра здравоохранения СССР т. Сафонова А.Г.

Министр
С.П.БУРЕНКОВ

Приложение
к Приказу Минздрава СССР
от 2 сентября 1985 г. N 1161

ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС

Настоящая инструкция от ранее утвержденной Министерством здравоохранения СССР в 1963 году отличается тем, что в составе комплекса серологических реакций на сифилис (КСР), предназначенного для диагностики данного заболевания, предусмотрено применение реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами и микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР). Более высокая чувствительность и информативность этого комплекса реакций обеспечивается выявлением не только реагинов, но и противотрепонемных антител. РСК с неспецифическим (вассермановским) антигеном и осадочные реакции цитохолевая и Кана из диагностического комплекса исключены как менее чувствительные и не дающие дополнительной информации.

Данная инструкция предусматривает применение следующих реакций для серо- и ликвордиагностики сифилиса, а также для отборочных исследований на сифилис:

1. МР с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови и инактивированной сывороткой крови;

2. РСК с трепонемным и кардиолипидовым антигенами; качественная и количественная методики постановки, термостатная и на холоде;

3. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ); пробирочная и меланжерная методики постановки;

4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ с абсорбцией (РИФ-абс) с сывороткой крови и капиллярной кровью, РИФ-200, РИФ с цельной спинномозговой жидкостью (РИФ-ц); качественные и количественные методики постановки.

В связи с различной чувствительностью, специфичностью и сложностью постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.

Профилактическое обследование населения на сифилис должно проводиться с помощью экспресс-метода или КСР. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей, однако необходимо учитывать, что широкое внедрение в практику экспресс-метода рассчитано, в основном, не на замену им КСР, а на резкое увеличение контингентов, профилактически обследуемых на сифилис. РСК с трепонемным антигеном является более чувствительной реакцией, чем МР, особенно при поздних формах сифилиса, когда в крови больных могут отсутствовать или быть в низкой концентрации реагины.

С помощью микрореакции обследуются лица, подлежащие периодическим медицинским осмотрам на венболезни, а также лица, помещенные в медицинские вытрезвители, спецприемники, приемники-распределители, изоляторы для временного содержания под стражей, условно-досрочно освобожденные и направляемые на стройки народного хозяйства, а также условно осужденные, состоящие на учете в спецкомендатурах.

МР при изолированном применении является не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании ее позитивности диагноз сифилиса не устанавливается, а обследуемые направляются к дерматовенерологу, который должен подвергнуть их клиническому обследованию и организовать исследование их крови в КСР, РИТ, РИФ.

КСР применяется для диагностики всех форм сифилиса, контроля эффективности лечения, обследования лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, лиц с клиническим и анамнестическим подозрением на сифилис, а также при профилактическом обследовании на сифилис больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, включая лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности. РСК на холоде применяется в случае получения отрицательного результата при использовании термостатного метода для диагностики всех форм сифилиса.

Из специфических реакций на сифилис наиболее широкое применение в Советском Союзе нашли РИТ и РИФ. Более специфичным тестом является РИТ; РИФ-абс и РИФ-200 по специфичности приближаются к ней. РИТ и РИФ необходимы для диагностики скрытых и поздних форм сифилиса, распознавания ложно-положительных результатов КСР и МР, особенно у беременных и соматических больных, при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилитическую инфекцию, для установления ретроспективного диагноза заболевания, а также при установлении излеченности сифилиса. Но главным показанием к постановке РИТ является наличие положительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис у лиц без клинических и анамнестических признаков сифилиса, в то время как при обследовании половых контактов больных сифилисом и диагностике первичного серонегативного сифилиса лучшим диагностическим тестом является РИФ-абс, т.к. при ранних формах заболевания реагины, преципитины, комплементсвязывающие антитела и иммобилизины могут еще не выявляться. Отсутствие тех или иных антител или их малая концентрация в крови могут наблюдаться и при других формах сифилиса, главным образом, в поздней стадии заболевания, в связи с чем параллельная постановка нескольких специфических серологических тестов повышает возможность выявления больных сифилисом. Диагноз скрытого сифилиса требует обязательного подтверждения положительными результатами специфических серологических реакций.

Использование различных модификаций постановки серологических реакций на сифилис определяется целью исследования. Постановка РСК на холоде повышает чувствительность этой реакции. На результаты РИФ-абс целесообразно ориентироваться при диагностике тех форм заболевания, которым свойственна малая концентрация сифилитических антител в крови, т.к. при ее постановке исследуемая сыворотка крови разводится лишь в 5 раз. При серологическом обследовании новорожденных детей, а также при невозможности получения крови из вены у взрослых и детей следует использовать методику постановки РИФ-абс с капиллярной кровью. При серологическом обследовании больных сифилисом в процессе и после окончания лечения применяются РСК и МР в количественном варианте, комплекс серологических реакций с реакцией Кана, РИТ, РИФ. С целью ликвордиагностики сифилиса надо применять наиболее чувствительную РИФ-ц, при невозможности ее постановки - РСК на холоде.

При постановке серологических реакций на сифилис должен соблюдаться ряд условий. МР с плазмой может осуществляться только в день взятия крови из пальца, при транспортировке ее необходимо предохранять от замерзания и высушивания. При невозможности выполнения этих требований МР должна ставиться с инактивированной сывороткой крови. В КСР, РИТ и РИФ можно исследовать с диагностической целью высушенные на вощаной бумаге или целлофане сыворотки крови в тех случаях, когда нет возможности провести исследование нативной сыворотки крови, однако кровь доноров и (беременных должна исследоваться и нативном состоянии.

При изолированном исследовании в МР сыворотка крови и плазма должны быть нативными.

Постановка МР, как составной части КСР на сифилис, должна осуществляться в серологических лабораториях. При изолированном использовании МР в качестве отборочного теста ее постановку можно проводить как в серологических лабораториях, так и в клинико-диагностических с целью широкого охвата населения профилактическим обследованием на сифилис.

Для постановки МР должны быть выделены врачи, лаборанты, медицинские сестры, прошедшие специальную подготовку по этому вопросу. Средний медицинский персонал производит взятие крови из пальца и постановку МР, в то время как учет ее результатов осуществляют врачи-лаборанты или врачи другой специальности, получившие соответствующую подготовку. Врачи несут ответственность за постановку экспресс-метода.

Постановка КСР и специфических реакций на сифилис производится в серологических лабораториях кожно-венерологических учреждений, а в сельской местности постановка КСР - в лабораториях сельских районных больниц.

Подготовка врачей-серологов и повышение их квалификации должны осуществляться в кожно-венерологических учреждениях (научно-исследовательских кожно-венерологических институтах, республиканских, областных, краевых и тех городских кожно-венерологических диспансеров, на которые возложены функции организационно-методических центров), а также на кафедрах микробиологии и лабораторной клинической диагностики институтов и факультетов усовершенствования врачей.

Обучение врачей и среднего медицинского персонала постановке МР должно осуществляться в серологических лабораториях научно-исследовательских кожно-венерологических институтов, краевых, областных и городских кожно-венерологических диспансеров.

Серологические лаборатории научно-исследовательских кожно-венерологических институтов, республиканских, краевых, областных и городских кожно-венерологических диспансеров должны осуществлять контроль качества всех применяемых серологических реакций в лабораториях подведомственных территорий. Большое внимание необходимо уделять контролю качества постановки МР, т.к. она осуществляется не только в серологических лабораториях, имеющих квалифицированные кадры серологов, но и в клинико-диагностических лабораториях.

Отборочные микрореакции преципитации

Принцип

При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.

Оборудование, необходимое для взятия крови из пальца и вены и постановки реакции

Капиллярные пипетки аппарата Панченкова.

Градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл.

Пастеровские пипетки.

Пробирки длиной 8-10 см и 14-15 см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные.

Пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см.

Иглы для взятия крови из пальца и из вены.

Резиновая груша.

Центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин.

Аппарат для встряхивания.

Стерилизатор для кипячения игл, шприцев, инструментов.

Ингредиенты

Антиген кардиолипиновый для микрореакции.

Холин-хлорид (включается в упаковку с антигеном).

Натрий хлорид х.ч.

Натрий лимоннокислый (цитрат натрия) трехзамещенный (Na3C6H5O7 x 5H2O).

Мертиолат C9H9O2S NaHg.

Растворы

Изотонический раствор хлорида натрия 0,9%.

10% раствор холин-хлорида. Готовится следующим образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата и 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10% раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Раствор стойкий, при отсутствии бактериального загрязнения хранится 10-12 месяцев при 4°.

5% раствор трехзамещенного цитрата натрия готовится на дистиллированной воде и фильтруется. Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять свежим. Хранится в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови, необходимые для установления пригодности эмульсии антигена, выпускает Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов. Отрицательную и положительную сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые, с целью экономии, разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции свежую или размороженную в одной пробирке сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.

Титрование сыворотки крови проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунку по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая и выпуская его в лупку 5-6 раз. Затем набирают часть содержимого второй лупки в пастеровскую пипетку и три капли переносят в третью лунку, а оставшуюся в пипетке сыворотку крови возвращают во вторую лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и три капли переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки три капли удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсин кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 минут, добавляют по три капли изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после этого регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/2+), используют в качестве слабоположительнго контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1 : 8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+- в разведении не ниже, чем 1 : 2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше, чем 1 : 4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивания, т.к. в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.

Серологические лаборатории кожно-венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс-метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации, выпускаемого Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов Министерства здравоохранения СССР. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина, их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37° или 56° соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3, 5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин-хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин-хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин-хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают, опрокидывая пробирку, до полного ресусиендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнения при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4° не более недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс-методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагинов, отличающихся на ё1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови, а также отсутствие преципитата в отрицательной сыворотке крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а) слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови, б) более низкий (на 2 - 3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией, в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови

Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки "К", возвращают во флакон раствор до метки "25", а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки "К", перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают пастеровской пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови

Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки микрореакции с плазмой и инактивированной сывороткой крови

Пастеровской пипеткой насасывают плазму или инактивированную сыворотку крови и вносят по три капли в лунки, куда затем добавляют одну каплю эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или инактивированную сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют ее соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по три капли изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28°). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

Оценка результатов реакции

Результаты учитывают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. В лунках с плазмой или сывороткой крови, взятых от больных сифилисом, выпадают различной величины хлопья. Появление крупных хлопьев расценивают как положительный результат (4+, 3+), средней величины и мелких - как слабоположительный результат (2+, 1+). При отрицательном результате хлопья не образуются. В сомнительном случае (+/-) необходимо ориентироваться на контроль отрицательной сыворотки крови. Если в нем хлопья отсутствуют, а в образцах плазмы или сыворотки крови обследуемых лиц образуются мелкие хлопья, результат в этом случае расценивают как сомнительный (+/-) и исследование повторяют по количественному методу, так как может наблюдаться феномен прозоны, когда в неразведенной сыворотке крови видимый преципитат отсутствует, а в ее разведениях он появляется. Количественная методика применяется также для суждения о концентрации антител в крови больного в процессе и после лечения.

Количественная методика постановки микрореакции

В девять лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по три капли изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по три капли исследуемой сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая его в пипетку и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем часть содержимого набирают в пипетку и три капли переносят в третью лунку, а оставшееся в пипетке возвращают во вторую лунку. Из третьей лунки три капли переносят в четвертую и т.д. до десятой лунки, из которой три капли удаляют. Таким образом, получают двухкратные разведения сыворотки крови 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 и далее до 1 : 516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только три капли сыворотки крови, т.е. исследуют цельную сыворотку крови. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки вносят по три капли изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной методики.

Источники ошибок

Неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток).

Исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных.

Неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием.

Бактериальное загрязнение эмульсии.

Нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсин, растворов.

Замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным.

Использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.

Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

Комплекс стандартных серологических реакций

Реакция связывания комплемента (реакция Вассермана)

Принцип

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами (ультраозвученный трепонемный антиген). Образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбирует вводимый в реакцию, комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана).

Оборудование

Термостат с температурой 37°.

Холодильник с температурой 4°.

Инактиватор (водяная или суховоздушная баня) с температурой 56°. Центрифуга.

Пробирки размером 14 x 60 мм, 15 x 100 мм, 15 x 150 мм

Пипетки градуированные 1, 2 мл с делениями на 0,01 мл

Пипетки градуированные 5, 10 мл с делениями на 0,1 мл

Цилиндры мерные емкостью 100, 250, -500, 1000 мл с делениями на 5 мл.

Стаканы химические, емкостью 100, 250, 500 мл.

Приборы дозировочные для серологических исследований (Флоринского) - ФЛ-3 и ФЛ-4.

Ингредиенты:

0,9% изотонический раствор натрия хлорида.

Испытуемая сыворотка крови.

Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов, перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, беременных в последние 10 дней беременности, рожениц в первые 10 дней после родов, новорожденных в первые 10 дней жизни.

Кровь из локтевой вены в количестве 7 - 10 мл берут в сухую чистую пробирку. Пункцию производят стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь берут из надреза пятки узким скальпелем.

В лабораторию кровь должна быть доставлена не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при 4°.

Сыворотка крови может быть использована для постановки реакции в день взятия крови.

Доставленную в лабораторию кровь в день ее взятия помещают в термостат при 37° на 15-30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин. Над сгустком образуется прозрачная сыворотка крови, которую при помощи пипетки с резиновым баллоном без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотке крови примеси эритроцитов ее центрифугируют и отделяют от них. Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и помещают в холодильник при 4°. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят в другую пробирку.

Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют в суховоздушном инактиваторе или водяной бане в течение 30 минут при 56° для уничтожения естественного комплемента и стабилизации глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови.

Инактивированные сыворотки крови могут храниться в холодильнике в течение 5-6 дней. Сыворотки крови, ранее инактивированные, в день постановки реакции должны быть повторно прогреты в течение 15 минут при 56°. Для более длительного хранения к сыворотке крови после инактивации добавляют сухую борную кислоту (из расчета 2%), что позволяет ею пользоваться в течение 3-4 недель, или замораживают в морозильной камере холодильника на тот же срок, не допуская повторного замораживания и оттаивания.

В случаях, если нельзя немедленно доставить кровь для исследования в лабораторию, можно пользоваться высушенной сывороткой крови. Для этого 2 мл сыворотки крови без примеси эритроцитов наносят на сложенную вдвое вощаную бумагу, целлофан (8 x 10 см) в виде четырех кружочков по 0,5 мл в каждом. К сыворотке крови добавляют по 3 капли свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара на каждые 0,5 мл сыворотки. Предварительно на вощаной бумаге, целлофане надписывают фамилию, имя, отчество, дату взятия крови и объем нанесенной сыворотки крови, которую высушивают при комнатной температуре. Затем вощаную бумагу, целлофан тщательно свертывают в виде аптечного пакетика и в конверте по почте отправляют в ближайшую серологическую лабораторию. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней с момента взятия крови в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны.

В лаборатории полученную высушенную сыворотку крови ссыпают в пробирку. Для ее растворения добавляют изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая первоначальный объем сыворотки крови. Сыворотка крови растворяется в течение одного часа стояния при комнатной температуре. Затем ее инактивируют при 56° в течение 30 минут, после чего она может быть использована для постановки реакции.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови для исследования не пригодны.

Антигены

Реакция Вассермана должна ставиться с двумя антигенами: ультраозвученным трепонемным и кардиолипиновым.

Ультраозвученный трепонемный антиген приготовлен из культур бледных трепонем, подвергнутых действию ультразвука.

Ультраозвученный трепонемный антиген выпускают лиофильно высушенным во флаконах по 5 и 10 мл; хранят его в холодильнике при 4°. Срок годности антигена указан на этикетке. Антиген растворяют и разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно объему и титру, указанному на этикетке флакона.

Кардиолипиновый антиген для реакции Вассермана представляет собой очищенный от балластных примесей спиртовый экстракт липидов из мышц бычьего сердца. Активность антигена обусловливается присутствием трех компонентов - фосфолипида, лецитина и холестерина.

Кардиолипиновый антиген выпускается в ампулах 2 мл; хранят его в темном месте при 15 - 18°. Срок годности антигена указан на этикетке.

Перед употреблением антиген из ампулы переносят в сухую чистую пробирку, плотно закрывают корковой или притертой стеклянной пробкой.

В случае выпадения кристаллов холестерина антиген необходимо прогреть на водяной бане при 56° или в термостате при 37° до полного растворения кристаллов.

Для постановки реакции антиген разводят соответственно титру, указанному на этикетке ампулы. Разведенный антиген должен быть слегка опалесцирующим, но не мутным.

Титр - это количество чистого антигена в 1 мл раствора. Например, если титр ультраозвученного трепонемного антигена 0,05, то для приготовления 10 мл разведенного по титру антигена нужно взять 0,5 мл антигена и 9,5 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Двойные дозы антигенов не должны обладать гемотоксичностью (гемолиз в отсутствии комплемента), что устанавливается соответствующим контролем антигена при титровании комплемента. Антигены не должны быть антикомилементарными (подавление гемолиза), что также устанавливают при параллельном титровании комплемента без генов и в присутствии антигенов, применяемых в реакции связывания комплемента.

Гемолитическая сыворотка (гемолизин)

Это сыворотка крови кролика или осла, иммунизированных эритроцитами барана.

Гемолитическая сыворотка (жидкая или сухая) выпускается в ампулах по 1 мл с указанием титра. Для растворения сухого гемолизина в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Гемолитическая сыворотка как сухая, так и растворенная хранится в холодильнике при 4°. Срок годности сухой гемолитической сыворотки указан на этикетке.

Титр используемой гемолитической сыворотки не должен быть ниже 1 : 1200. Определение титра производят по следующей схеме: готовят основное разведение 1 : 100 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида), из которого делают ряд соответствующих разведений (таблица N 1).

Таблица N 1

Схема разведений гемолизина

NN пробирок Гемолизин (мл) Изотонический раствор натрия хлорида (мл) Разведение гемолизина
1 0,1 (не разведенный) 9,9 1 : 100
2 0,5 1-го разведения 4,5 1 : 1000
3 0,5 -"5,5 1 : 1200
4 0,5 -"7,0 1 : 1500
5 0,5 -"8,5 1 : 1800
6 0,5 -"10,0 1 : 2100
7 0,5 -"11,5 1 : 2400
8 0,5 -"13,0 1 : 2700
9 0,5 -"14,5 1 : 3000
10 0,5 -"22,0 1 : 4000

Затем в ряд других пробирок отмеряют по 0,5 мл ранее приготовленных разведении гемолитической сыворотки, начиная с 1 : 1000, добавляют по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,5 мл комплемента (комплемент в разведении 1 : 10), а также 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (таблица N 2); пробирки помещают в термостат при 37° на 1 час, периодически встряхивая 2-3 раза.

Титром гемолитической сыворотки является наивысшее ее разведение, давшее полное растворение 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента. В данном случае титр гемолитической сыворотки - 1 : 1500 (таблица N 2).

Для основного опыта и титрования ингредиентов берут разведение, усиленное против полученного титра в три раза (тройной титр). В данном примере - 1 : 500 (0,1 на 50).

Таблица N 2

Определение титра гемолизина

NN пробирок соотв. табл. N 1 Разведение гемолизина Гемолизин в соотв. разведениях (мл) Изотонический раствор натрия хлорида (мл) Комплемент 10% (мл) 3% взвесь эритроцитов барана (мл)  Результат
1 1 : 1000 0,5 1,0 0,5 0,5 Поместить в термостат при 37° на 1 час. Гемолиз
2 1 : 1200 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
3 1 : 1500 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
4 1 : 1800 0,5 1,0 0,5 0,5 Задержка
      гемолиза
5 1 : 2100 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
6 1 : 2400 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
7 1 : 2700 0,5 1,0 0,5 0,5 Наблюдать ход гемолиза через 15-30-"
8 1 : 3000 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
9 1 : 4000 0,5 1,0 0,5 0,5 -"
      -"
 Контрили      
       
10 1 : 1000 0,5 1,5  0,5 -"
11 1 : 1000  1,5 0,5 0,5 60 минут -"
12 1 : 1000  2,0  0,5 -"

Эритроциты барана

Баран должен быть в возрасте от 1 до 5 лет. Кровь у него берут путем пункции яремной вены не чаще 1 раза в 10 дней, в количестве не более 200 мл в сухую стерильную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают в течение 5-10 минут. Затем кровь фильтруют через двойной слой марли (отделяют образовавшиеся сгустки нитей фибрина).

В день постановки реакции эритроциты барана трех - пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют для его уплотнения. Надосадочную жидкость вновь удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида (на 3 мл плотного осадка эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора натрия хлорида). Отмытые эритроциты в последующие дни в работе не используют. При наличии гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.

Дефибринированную кровь сохраняют в широкогорлом сосуде, накрытом стерильной двухслойной марлевой салфеткой в течение 5-7 дней в холодильнике при 4°.

Для хранения дефибринированной крови барана длительное время рекомендуется консервировать ее по методу Мигулиной. Для этого к 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы - 6,0 г, борной кислоты - 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида; приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня подряд по 20 минут. Консервированная кровь барана по методу Мигулиной годна к употреблению в течение 3-4 недель. Перед постановкой реакции при использовании консервированной крови эритроциты необходимо отмывать изотоническим раствором натрия хлорида так же, как неконсервированной.

Комплемент

Применяют смесь сыворотки крови, полученной пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. Кровь для лучшего свертывания помещают в термостат при 37° на 30 минут. После образования сгустка последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в холодильник при 4° до следующего дня. Полученную прозрачную сыворотку крови сливают и используют как комплемент. Активность этого комплемента при хранении в холодильнике при 4° сохраняется в течение 1-2 суток.

При консервировании сухой борной кислотой и сернокислым натрием комплемент сохраняется в холодильнике при 4° 1-2 месяца (4,0 г борной кислоты + 0,5 г сернокислого натрия на 100 мл комплемента).

Может быть использован лиофильно высушенный комплемент. Сухой комплемент выпускается в ампулах по 1 мл.

Растворение сухого комплемента производят в день постановки реакции изотоническим раствором натрия хлорида при легком встряхивании. В ампулу с сухим комплементом добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Нужное для постановки реакции количество комплемента смешивают из нескольких ампул одной серии.

Непосредственно перед постановкой реакции Вассермана проводят титрование комплементы в присутствии всех ингредиентов, участвующих в опыте.

Комплемент титруют обязательно: а) в чистом виде (без антигенов), т.е. в присутствии только гемолитической системы и б) с каждым антигеном, входящим в опыт. Титрование комплемента проводят также в присутствии инактивированной отрицательной сыворотки крови человека.

При титровании комплемента ингредиенты разводят в следующем порядке:

1. Разводят гемолитическую сыворотку по утроенному титру в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе натрия хлорида.

3. Разливают 3% взвесь эритроцитов барана и изотонический раствор натрия хлорида в 5 контрольных пробирок и разведенную по утроенному титру гемолитическую сыворотку (во второй контроль) - таблица N 3.

4. Готовят гемолитическую систему: раствор гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру, приливают к равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание путем переливания из одной колбы в другую.

Полученную смесь помещают в термостат при 37° на 30 минут для сенсибилизации эритроцитов.

5. Разводят антигены изотоническим раствором натрия хлорида по указанному на этикетке титру.

6. Разводят заведомо отрицательную инактивированную сыворотку крови человека в соотношении 1 : 5 (2 мл сыворотки крови + 8 мл изотонического раствора натрия хлорида).

7. Разводят комплемент 1 : 10 (1 мл комплемента + 9 мл изотонического раствора натрия хлорида).

Титрование комплемента в объеме 1,25 мл

Таблица N 3

Схема проведения контроля

Ингредиенты (мл) общий объем - 1,25 мл) Контрольные пробирки
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
Гемолитическая сыворотка, разведенная по утроенному титру  0,25    
3% взвесь эритроцитов барана 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Комплемент 1 : 10 0,25     
Изотонический раствор натрия хлорида 0,75 0,75 1,0 0,5 0,5
Антиген трепонемный, разведенный по титру    0,5  
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру     0,5
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Результат
 После 45 минут пребывания в термостате при 37° во всех контрольных пробирках должен отсутствовать гемолиз (-Г).

Титрование комплемента проводят в 30 пробирках, поставленных по 10 штук в три ряда. Два ряда пробирок для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (таблица N 3).

Комплемент, разведенный 1 : 10, разливают в 10 пробирок первого ряда в дозах: 0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,55 мл (таблица N 4).

Таблица N 4

Титрование комплемента в присутствии антигена и
отрицательной сыворотки крови человека
 

Ингредиенты (мл) (общий объем - 1,25 мл) NN пробирок
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Комплемент 1 : 10 0,1 0,16 0,2 0,24 0,3 0,36 0,4 0,44 0,5 0,55
Изотонический раствор натрия хлорида 0,9 0,84 0,8 0,76 0,7 0,64 0,6 0,56 0,5 0,45
После тщательного перемешивания из каждой пробирки переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие сзади пробирки второго, третьего ряда и 0,25 мл выливают
Отрицательная инактивированная сыворотка крови человека 1 : 5 по 0,25 мл во все 30 пробирок
Антиген трепонемный, разведенный по титру 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
 (первый ряд пробирок)
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
 (второй ряд пробирок)
Изотонический раствор натрия хлорида 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
 (третий ряд пробирок)
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
 (первый и второй ряды)
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Результат
Примечание: -Г (задержка гемолиза); +Г (гемолиз).

Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими объемами изотонического раствора натрия хлорида: 0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,45 мл.

Полученную в каждой пробирке смесь тщательно перемешивают и переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие позади два ряда пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 30 пробирок разливают по 0,25 мл инактивированной отрицательной сыворотки крови человека, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5. Далее в 10 пробирок первого ряда приливают по 0,25 мл разведенного по титру трепонемного антигена; разведенный по титру кардиолипиновый антиген приливают по 0,25 мл в 10 пробирок второго ряда; изотонический раствор натрия хлорида приливают по 0,25 мл в 10 пробирок третьего ряда.

Штатив с пробирками встряхивают и добавляют по 0,5 мл гемолитической системы в третий ряд пробирок (без антигенов). Штатив с пробирками вновь встряхивают и помещают на 45 минут в термостат при 37°. После инкубации в термостате в 20 пробирок первого и второго рядов добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. Содержимое пробирок вновь встряхивают и помещают в термостат при 37° на 45 минут. По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента, которая устанавливается следующим образом: в основу берут титр комплемента без антигенов, затем титр комплемента в присутствии антигенов, к которому делают надбавку в пределах 15-30% (в среднем 20%) в зависимости от степени гемолиза в пробирках с меньшим количеством комплемента (таблица N 4).

Титром комплемента является наименьшее его количество, способствующее полному гемолизу эритроцитов барана в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

В данном случае титр комплемента будет 0,3, а рабочая доза комплемента - 0,36, т.е. 3,6%.

Для каждого рабочего дня готовят необходимый объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 0,75 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку крови при условии постановки реакции Вассермана с двумя антигенами. Так, на 100 испытуемых сывороток крови необходимо 75 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 72,3 мл изотонического раствора натрия хлориды нужно прибавить 2,7 мл комплемента.

В случае получения разных титров комплемента в присутствии трепонемного и кардиолипинового антигенов используют разные рабочие дозы комплемента в соответствии с полученными титрами.

Качественная методика постановки реакции Вассермана

В день постановки опыта проводят подготовительную работу (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, отмывание эритроцитов барана от плазмы крови, приготовление изотонического раствора натрия хлорида).

Разводят ингредиенты: гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, антигены по титру. Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без антигенов, в присутствии антигенов.

Расход ингредиентов на 100 исследований

Натрий хлорид х.ч. - 18 г
Кардиолипиновый антиген (РСК) - 0,1 мл
Ультраозвученный трепонемный антиген - 2,5 мл
Комплемент - 4,5 мл
Гемолитическая сыворотка - 0,3 мл
Эритроциты барана с плотного осадка - 3,5 мл

Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент, разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольные пробирки. Предварительное смешивание антигена и комплемента не рекомендуется. После первичной 45-минутной инкубации в термостате при 37° добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37° на 45-50 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов

Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:

полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - 1+; сомнительная реакция - +/-. Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Таблица N 5

Качественная методика постановки реакции Вассермана

Ингредиенты (мл) (общий объем - 1,25 мл) NN пробирок
1 2 3 (контроль)
Испытуемая инактивированная сыворотка крови, разведенная 1 : 5 0,25 0,25 0,25
Положительная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1 : 5 0,25 0,25 0,25
Слабоположительная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1 : 5 0,25 0,25 0,25
Отрицательная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1 : 5 0,25 0,25 0,25
Антиген трепонемный, разведенный по титру 0,25   
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру  0,25  
Изотонический раствор натрия хлорида   0,25
Комплемент, разведенный по рабочей дозе 0,25 0,25 0,25
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке

Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории.

Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно.

В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторное исследование новой порции сыворотки крови; повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).

Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:

1) контроля испытуемой сыворотки крови - третий ряд пробирок (отрицательный);

2) контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);

3) контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.

В качестве контрольных используют лиофилизированные сыворотки крови.

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56° в течение 30 минут. Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+ соответственно при разведении 1: 5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови.

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Количественная методика постановки реакции Вассермана

Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови производится путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объемов сыворотки крови, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод постановки реакции Вассермана ставят с положительными сыворотками крови, давшими 4+ с кардиолипиновым или трепонемным антигенами.

Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56° в инактиваторе.

Каждую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках (таблица N 6). В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического раствора натрия хлорида, со второй по 7-ю пробирку - по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл удаляют, а по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из третьей - в четвертую и т.д. до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки крови удаляют. Затем приливают по 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру, с первой по седьмую, а в 8-ю пробирку 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45-60 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее задержку гемолиза.

Таблица N 6

Количественная методика постановки реакции Вассермана

Ингредиенты (в мл) (общий объем - 1,25 мл) NN пробирок
1 2 3 4 5 6 7 8
Изотонический раствор натрия хлорида 0,8 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25  
Испытуемая инактивированная сыворотка крови 0,2 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 0,25
 После перемешивания из 1 пробирки 0,25 мл удаляют, а во II и VIII пробирки переносят по 0,25 мл. Из II пробирки после перемешивания переносят последовательно из пробирки в пробирку (из II в III, из III в IV и т.д. до VII пробирки включительно) по 0,25 мл. Из VII пробирки 0,25 мл удаляют. Получают разведения сыворотки крови: 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:5
Антиген, разведенный по титру (кардиолипиновый или трепонемный) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25  
Изотонический раствор натрия хлорида        0,25
Комплемент, разведенный по рабочей дозе 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке
Результат 4+ 4+ 4+ 3+     

В данном случае титр сыворотки крови 1 : 40

В выдаваемых лабораторией анализах при наличии резкоположительной реакции (4+) указывают, с каким титром испытуемой сыворотки крови получена положительная реакция.

Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно не снижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и необходимость ее изменения.

Источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана.

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут находиться противотрепонемные антитела и реагины, способные вступать в реакцию связывания комплемента с соответствующими антигенами.

Реакцию ставят с непрогретой спинномозговой жидкостью, ввиду отсутствия в ней комплемента.

Мутную или с примесью крови жидкость центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость.

Спинномозговую жидкость параллельно исследуют в трех дозах: 1) неразведенную; 2) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 2, 3) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5 (таблица N 7).

Реакцию производят с двумя антигенами параллельно - трепонемным и кардиолипиновым - с каждым разведением спинномозговой жидкости по схеме (таблица N 7).

Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования комплемент в реакцию вводят по титру (первая растворяющая доза без обычной надбавки). Для повышения чувствительности реакции связывания комплемента со спинномозговой жидкостью рекомендуется применять модификацию на холоде, методика которой изложена ниже.

Оценка результатов

Результаты реакции учитывают отдельно для каждого антигена и разведения спинномозговой жидкости. Для обозначения позитивности реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью пользуются системой четырех плюсов, описанной выше.

Таблица N 7

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

Ингредиенты (в мл) (общий объем - 1,25 мл) NN пробирок
1 2 3 4 5 6 7 (контроль)
Спинномозговая жидкость 0,05 0,05 0,13 0,13 0,25 0,25 0,25
Изотонический раствор натрия хлорида 0,2 0,2 0,12 0,12 --0,25
Антиген трепонемный, разведенный по титру 0,25 -0,25 -0,25 --
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру -0,25 -0,25 -0,25 -
Комплемент, разведенный по титру 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления гемолиза в контрольной пробирке

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения спинномозговой жидкости, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде

Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. При выборе рабочей дозы комплемента ее вычисляют с 50% надбавкой к рабочей дозе, полученной при титровании комплемента для качественной реакции Вассермана.

Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, исследуют в 3 пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, разведенного по титру; во вторую 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру; в третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После встряхивания все пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут (первая фаза реакции). Затем добавляют комплемент по 0,25 мл, разведенный с 50% надбавкой к рабочей дозе во все опытные и контрольные пробирки. После встряхивания все пробирки помещают в холодильник при 4° на 15-18 часов (вторая фаза реакции). В аналогичных условиях выдерживается гемолитическая система. На следующий день содержимое пробирок и гемолитическую систему выдерживают при комнатной температуре 15 минут с последующей инкубацией в термостате при 37° 15 минут, после чего во все пробирки добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. После встряхивания пробирки помещают в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке исследуемой сыворотки крови (третья фаза реакции) (таблица N 8).

Оценка результатов и источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана по термостатному методу.

Таблица N 8

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде

Ингредиенты (мл) (общий объем - 1,25 мл) NN пробирок
1 2 3 (контроль)
Испытуемая инактивированная сыворотка крови, разведенная 1 : 5 0,25 0,25 0,25
Антиген трепонемный, разведенный по титру 0,25   
Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру  0,25  
Изотонический раствор натрия хлорида   0,25
Встряхнуть, выдержать 10 минут при комнатной температуре
Комплемент, разведенный с 50% надбавкой к рабочей дозе 0,25 0,25 0,25
Встряхнуть, поместить, в холодильник при 4° на 15-18 часов. На следующий день содержимое пробирок и гемолитическая система выдерживается при комнатной температуре 15 минут с последующей инкубацией в термостате при 37° 15 минут
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5
Встряхнуть, поместить, в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке

Реакция Кана

Принцип

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом вступают в соединение с липидным антигеном (антиген Кана). Образующийся комплекс антиген-антитело выпадает в осадок в виде макрофлокулята.

Оборудование

Холодильник с температурой 4-6°.

Термостат с температурой 37°.

Центрифуга.

Инактиватор с температурой 56°.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Пробирки размером 11 x 75 мм.

Пипетки градуированные 0,1 и 0,2 мл с делениями на 0,001.

Пипетки градуированные на 1, 2 мл с делениями на 0,01.

Пипетки градуированные 5, 10 мл с делениями на 0,1.

Стеклянные стаканчики емкостью 20, 50 мл.

Банки стеклянные емкостью 50, 100, 200 мл.

Ингредиенты

0,9% изотонический раствор натрия хлорида. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 9 г натрия хлорида, химически чистого. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Антиген Кана. Антиген разводят по титру способом, указанным на этикетке. Хранят в темном месте при комнатной температуре во флаконах или пробирках плотно закрытых корковыми пробками.

Испытуемая сыворотка крови. Взятие крови, получение сыворотки крови и обработка испытуемой сыворотки крови производится также, как для реакции Вассермана.

Методика постановки реакции

Подготовительная работа

Приготовление 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, разведение антигена по титру.

Расход ингредиентов на 100 исследований

Натрий хлорид, х. ч. - 9 г.

Антиген Кана - 1,8 мл.

Приготовление разведения антигена

Антиген разводят по титру, указанному на этикетке, который, как правило, бывает 1+1, 1+1,1, 1+1,2, 1+1,3, т.е. на каждый 1 мл антигена добавляют 1 мл, 1,1 мл, 1,2 мл, 1,3 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Для приготовления разведенного антигена в низкий стеклянный стаканчик отмеривают необходимый для данного рабочего дня объем 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, во второй стеклянный стаканчик - необходимое количество антигена Кана. Для отмеривания антигена Кана обязательно пользоваться сухой пипеткой. Затем 0,9% изотонический раствор натрия хлорида быстро вливают в антиген и смесь перемешивают, переливая из стаканчика в стаканчик 6-7 раз. Разведенный антиген оставляют на 10 минут при комнатной температуре (созревание). Созревшая антигенная эмульсия пригодна в течение 15 минут. Поэтому при большом количестве исследуемых сывороток крови рекомендуется готовить разведение отдельными порциями.

Основной опыт

В пробирку, опущенной на дно градуированной пипеткой (на 0,1 или 0,2 мл), вносят 0,025 мл разведенного антигена. Затем приливают 0,15 мл исследуемой инактивированной сыворотки крови и встряхивают на шуттель-аппарате 3 минуты, затем приливают 0,5 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида и вновь встряхивают до полного перемешивания содержимого пробирки. Для опыта ставят 4 контроля: контроль антигена, контрольные положительную, слабо-положительную и отрицательную сыворотки крови (табл. N 9).

Таблица N 9

Методика постановки реакции Кана

Ингредиенты (мл) NN пробирок
1 2 3 4 5
контроли
Антиген, разведенный по титру 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Сыворотка крови испытуемая инактивированная 0,15     
Сыворотка крови контрольная положительная  0,15    
Сыворотка крови контрольная слабоположительная   0,15   
Сыворотка крови контрольная отрицательная    0,15  
0,9% изотонический раствор натрия хлорида     0,15
Встряхивание в течение 3 минут
0,9% изотонический раствор натрия хлорида 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Встряхивание до смешивания содержимого пробирок

Оценка результатов

Определение результатов реакции Кана производят непосредственно после добавления 0,9% изотонического раствора натрия хлорида невооруженным глазом или при помощи лупы или агглютиноскопа. Для обозначения степени позитивности реакции Кана пользуются системой четырех плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость прозрачная - 4+, резко положительная реакция; образование ясного преципитата со значительным просветлением жидкости - 3+, положительный результат реакции, образование преципитата со взвешенными мелкими частицами в мутноватой жидкости - 2+, слабо положительная реакция; мелкие частицы взвешены в мутной жидкости - 1+, сомнительная реакция; отсутствие взвешенных частиц в прозрачной опалесцирующей жидкости в опытной пробирке, в пробирках с контролем антигена и заведомо отрицательной сывороткой крови регистрируют как отрицательный результат реакции Кана.

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Нарушение условий и срока хранения испытуемых сывороток крови, антигена.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Исключение из постановки реакции контрольных положительной, слабоположительной и отрицательной сывороток крови.

Использование загрязненной лабораторной посуды и пипеток.

Реакция иммобилизации бледных трепонем

Принцип

Реакция основана на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизируюших противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в условиях анаэробиоза. Постановке реакции предшествует подготовительная работа.

Обработка лабораторной посуды

Вся лабораторная посуда (пипетки, пробирки, флаконы и т.п.), используемая для постановки реакции иммобилизации трепонем, должна быть стерильной. Перед стерилизацией ее моют без применения дезинфицирующих средств. Для этого после опыта пробирки и флаконы погружают в мыльную воду комнатной температуры, кипятят в течение 40 минут, охлаждают до 40° и моют водопроводной сначала теплой, а затем холодной водой, наливая ее в каждую пробирку 5-7 раз, после чего 1 раз промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют автоклавированием в течение 30 минут при 2 атмосферах по манометру. После стерилизации посуду вновь высушивают в сушильном шкафу и хранят в боксе в течение 7 дней.

Получение исследуемой сыворотки крови и ее обработка

Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме. После отмены бициллина кровь берут через 1 месяц. При использовании пенициллиназы при постановке реакции прекращение введения препаратов пенициллина не обязательно.

Кровь для реакции берут из локтевой вены натощак стерильно, в сухую, химически чистую и стерильную пробирку. Кожу локтевого сгиба перед проколом протирают 70° спиртом. Взятую кровь обрабатывают так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. В реакции используют сыворотку крови, инактивированную в течение 30 минут в водяной бане при 56° для исключения действия неспецифических иммобилизинов. При необходимости повторного исследования одной и той же сыворотки крови ее инактивирование проводят повторно, но в течение 15 минут. Перед исследованием сыворотку крови можно хранить в холодильнике в течение 10-15 дней при - 10°, а при 4° в течение 5 дней. Никаких консервантов в сыворотку крови не добавляют.

В реакции можно исследовать сыворотки крови, высушенные на вощаной бумаге, с добавлением по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки крови свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней после высушивания в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны. Следует помнить, что результаты исследования сыворотки крови с невысоким содержанием антител негативируются быстрее, поэтому не следует широко применять высушенные сыворотки крови. Для растворения к высушенным сывороткам крови, помещенным в пробирку, добавляют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая их первоначальный объем, после растворения стерилизуют кварцеванием в течение 30 минут, расположив пробирки на расстоянии 0,5 метра от кварцевой лампы.

Среда выживания для бледных трепонем

Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания. Рекомендуется среда N 2 ЦКВИ. Для приготовления среды берут 50 г говяжьего или кроличьего мяса, освобождают его от жира и сухожилий, измельчают, заливают 100 мл водопроводной воды и помещают в холодильник на 24 часа при 4° для экстрагирования. На следующий день кипятят в течение 10 минут кроличье мясо и 20 минут говяжье, охлаждают и фильтруют через многослойный бумажный фильтр. После фильтрования устанавливают РН = 7,2 - 7,4 добавлением 20° раствора едкого натрия. Приготовленную среду стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру и ампулируют. При условии сохранения стерильности среда пригодна для использования в течение 12 месяцев. Ампулы со средой хранят в холодильнике при 4°. Каждую новую партию среды вводят в опыт параллельно со старой средой для выяснения ее качеств.

Комплемент

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. В реакции применяют комплемент морской свинки. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем. При использовании среды N 2 ЦКВИ в микроанаэростатном методе количество комплемента составляет 27% от общего объема используемых в реакции реагентов, а при постановке в меланжерах - 40%.

Для получения комплемента кровь берут обязательно у нескольких морских свинок так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. После получения сыворотки крови ее наливают в стерильные пробирки по 1-4 мл и исследуют на стерильность. Для этого 1 мл сыворотки крови морской свинки оставляют в термостате при 37° на сутки. В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Пробирки с комплементом хранят в холодильнике при -10° в течение 2-3 недель. Повторно замораживание и оттаивание не рекомендуется. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов. Лиофильно высушенный без консерванта комплемент морской свинки также нельзя использовать в реакции, т.к. по качеству он хуже свежего.

Антиген

В качестве антигена в реакции применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика (7-9 суток после заражения). Используют бледные трепонемы штамма Никольса, которые еженедельно пассируют на кроликах. Зараженных кроликов содержат в светлых проветриваемых помещениях. Кормят полноценной пищей, содержащей витамины (морковь-обязательно). Для заражения следует брать здоровых кроликов - самцов весом 2,5-3 кг с отрицательным результатом серологических реакций на сифилис (КСР и РИТ). За 1-2 суток до заражения у кроликов выстригают шерсть в нижней части живота, внутренней поверхности бедер и мошонки. Для получения раннего специфического орхита кролика заражают введением внутрь каждого яичка по 1 мл взвеси бледных трепонем. Во взвеси должно содержаться более 50 микроорганизмов в каждом поле зрения микроскопа при использовании окуляра 7Х и объектива 40.

Введение животным гидрокортизона для подавления иммуногенеза не является строго обязательным. Применение его рекомендуется при уменьшении в яичках числа бледных трепонем при повторных пассажах (менее 50 при исследовании в темном поле зрения). Гидрокортизон вводят внутримышечно в дозе 20 мг перед заражением и в последующие 4-6 дней - 10 мг.

О появлении орхита свидетельствует увеличение размеров яичка и его уплотнение. Для удаления яичек кролика привязывают к станку, обескровливают пункцией сердца под эфирным наркозом, если кролик при этом не погибает, его забивают воздушной эмболией - введением 20 мл воздуха в сердце или в вену уха. Яички выводят через паховый канал в мошонку, поглаживая по животу от середины вниз до мошонки. Поверхность кожи мошонки накрывают стерильной резиновой салфеткой с разрезами, через которые выводят яички. Кожу мошонки над яичками протирают тампоном, смоченным эфиром, приподнимают ее пинцетом сначала над одним яичком и делают разрез ножницами, через который выводят яичко вместе с оболочками, отрезают его у основания ножницами и помещают в стерильную чашку Петри. Далее в условиях бокса каждое яичко освобождают от оболочек, придатков и жира. Помещают в стерильный бюкс, разрезают на 10-14 частей, заливают 5 мл среды N 2 ЦКВИ и полученную взвесь исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения на наличие бледных трепонем. Для этого на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят по капле жидкости из каждого бюкса. При наличии трепонем кусочки яичка вместе со средой из бюкса переносят во (флакон емкостью 50 мл и встряхивают во встряхивателе для вымывания микроорганизмов из ткани яичка. Время встряхивания зависит от числа обнаруженных микроорганизмов. При наличии 5-10 бледных трепонем в поле зрения встряхивание длится в течение часа, а при наличии 30-40 трепонем - только 20-30 минут. После встряхивания содержимое флакона переносят в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин для осаждения эритроцитов и кусочков тканей яичка. Надосадочную жидкость переносят в другую стерильную пробирку, из нее готовят препараты на предметном стекле, которые исследуют как было выше описано, определяя приблизительное число бледных трепонем в нескольких полях зрения.

Содержащуюся в пробирке густую взвесь бледных трепонем набирают в шприц и заражают подготовленных кроликов введением 1,0 мл взвеси внутрь каждого яичка.

Для приготовления антигена взвесь бледных трепонем разводят средой N 2 ЦКВИ так, чтобы в поле зрения было 10-15 микроорганизмов. Например, если во взвеси содержится 1000-1500 микроорганизмов в каждом поле зрения (т.е. трепонемы густо покрывают все поле зрения), то на 9,9 мл среды добавляют 0,1 мл взвеси трепонем и получают разведение в 100 раз.

Гемолитическая система

Дефибринированную баранью кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в данный день, центрифугируют, плазму отсасывают, а осадок трижды отмывают 6-7 объемами 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 1% взвесь эритроцитов барана в том же растворе. Нужный объем гемолитической сыворотки, разведенной в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру (например, если на этикетке указан титр 1 : 1200, то для разведения используют титр 1 : 400, т.е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на 39,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) объединяют с равным объемом 1% взвеси эритроцитов барана. Раствор гемолитической сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 минут при 37°.

Таблица N 10

Схема реакции иммобилизации бледных трепонем
(микроанаэростатная методика)

Ингредиенты (мл) Опыт Контроли ингредиентов
NN пробирок
1 опытная 2 контрольная 3 4 5 6 7 8 9
Исследуемая инактивированная сыворотка крови 0,05 0,05        
Комплемент активный 0,15  0,15  0,15  0,15   
Комплемент инактивированный  0,15  0,15  0,15  0,15  
Антиген 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35
Положительная инактивированная сыворотка крови   0,05 0,05      
Отрицательная инактивированная сыворотка крови     0,05 0,05    

Основной опыт

Постановку реакции проводят в боксе. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной. В обе пробирки вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена. В опытную пробирку наливают 0,15 мл активного комплемента, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием и помещают в микроанаэростат. Из микроанаэростата с помощью вакуумного насоса удаляют атмосферный воздух и заполняют его газовой смесью из баллона, в котором содержится азот (95 частей) и углекислый газ (5 частей). При заполнении микроанаэростата газовой смесью следят за тем, чтобы стрелка манометра не доходила до нулевого уровня. В этом случае удается избежать повышения давления внутри анаэростата выше атмосферного в связи с перемещением его из комнаты в термостат с температурой 35°, а также позволяет следить за герметичностью этого прибора. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, взятыми из предыдущего опыта, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Сыворотки крови исследуют по вышеописанной методике. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем (таблица N 10).

Разлив ингредиентов при постановке реакции производят в боксе, предварительно облученном бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут.

Оценку полученных результатов проводят через 18-20 часов. Пробирки вынимают из термостата и микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (статная и контрольная). Из каждой пары пробирок пастеровской пипеткой наносят капли на пронумерованные соответственно статным пробиркам предметные стекла, накрывают покровными стеклами 20 x 20 мм и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения с объективом 40, окуляром 10Х. Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных.

Если в опытном препарате содержится 13-19 подвижных бледных трепонем, то для получения более достоверного результата необходимо сосчитать не 25, а 50 микроорганизмов, также отмечая среди них число подвижных и неподвижных. При подсчете 50 бледных трепонем полученное число подвижных микроорганизмов делят на 2.

Если в контрольном препарате содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить. В контрольных пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных трепонем объясняется токсичностью исследуемой сыворотки крови, чаще всего вследствие примеси медикаментов, иногда бактериальным загрязнением.

При определении подвижности бледных трепонем следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У бледной трепонемы не всегда можно наблюдать сгибательные и контрактильные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Расчет процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле:

Х=А - В х100
А

где:

A - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке,

В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке,

X - процент иммобилизации.

Пример:24-21х100=12%
24

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице N 11 с применением вышеуказанной формулы. Реакция иммобилизации считается отрицательной, когда процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20, сомнительной от 21 до 30, слабоположительной от 31 до 50 и положительной выше 50. Сыворотки крови с сомнительными и слабоположительными результатами реакции нуждаются в повторном исследовании для получения более достоверных результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, давшие полное расхождение результатов с результатами стандартных серологических реакций. Эти сыворотки крови заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента

Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество комплемента в опытных пробирках, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена отсутствием комплемента, вследствие чего иммобилизины не могли проявить свою активность.

После регистрации результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

Источники ошибок

Токсичность исследуемой сыворотки крови.

Бактериальное загрязнение исследуемой сыворотки крови, комплемента, среды.

Недостаточное количество комплемента в опыте.

Нарушение герметичности микроанаэростата, проникновение в него кислорода из атмосферного воздуха.

Повышение или понижение температуры в термостате в течение реакции.

Кислотность или щелочность лабораторной посуды, использованной при постановке реакции.

Таблица N 11

Определение процента иммобилизации бледных трепонем

Кол-во подвижных трепонем в контрольных пробирках Количество подвижных трепонем в опытных пробирках
25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13
25 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
24 0 0 4 8 12 17 21 25 29 33 37 42 46
23 0 0 0 4 9 13 17 22 26 30 35 39 43
22 0 0 0 0 5 9 14 18 23 27 32 36 41
21 0 0 0 0 0 5 10 14 19 24 29 33 38
20 0 0 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35
19 0 0 0 0 0 0 0 5 11 16 21 26 32
18 0 0 0 0 0 0 0 0 6 11 17 22 28
17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 12 18 24
Кол-во подвижных трепонем в контрольных пробирках Количество подвижных трепонем в опытных пробирках
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
25 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100
24 50 54 58 62 67 71 75 79 83 87 92 96 100
23 48 52 56 61 65 70 74 78 83 87 91 96 100
22 45 50 54 59 64 68 73 77 82 86 91 95 100
21 43 48 52 57 62 67 71 76 81 86 90 95 100
20 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
19 37 42 47 53 58 63 68 74 79 84 89 95 100
18 33 39 44 50 56 61 67 72 78 33 89 94 100
17 29 35 41 47 53 59 65 71 76 82 88 94 100

Примечание: Ответ находит в точке пересечения горизонтальной строки с вертикальным столбцом, например: 22 подвижных трепонемы в контрольной пробирке и 8 подвижных трепонем в опытной пробирке соответствует 63% иммобилизации бледных трепонем.

Меланжерная методика постановки РИТ по Н.М. Овчинникову

Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота и углекислого газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

Ход определения

Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, которая состоит из следующих этапов:

1. Получение и обработка исследуемой сыворотки крови. Проводится так же, как и для микроанаэростатной методики.

2. Приготовление среды для бледных трепонем. Меланжерная методика реакции выполняется с той же средой, что и микроанаэростатная.

3. Комплемент. Готовится и хранится так же, как и при выполнении микроанаэростатной методики.

4. Антиген. Применяется тот же штамм бледной трепонемы и методика его приготовления та же, что и для микроанаэростатной методики.

5. Приготовление смеси антигена с комплементом "коктейля". Предварительно в двух стерильных флаконах или колбах соединяют комплемент с антигеном, взятых в равных объемах. Количество комплемента и антигена зависит от общего числа исследуемых сывороток крови. На одну сыворотку крови расходуется 0,15 мл комплемента и столько же антигена. Антиген разливают равными частями в два стерильных флакона и добавляют в один (флакон активный комплемент, а во второй - инактивированную сыворотку крови морской свинки (таблица N 12).

6. Гемолитическую сыворотку разводят так же, как и для микроанаэростатного метода.

7. Приготовление изотонического раствора хлорида натрия. Растворяют 9,0 г натрия хлорида химически чистого в 1 литре дистиллированной воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру.

8. Всю лабораторную посуду промывают и стерилизуют так же, как при постановке микроанаэростатного метода.

Таблица N 12

Расчет количества ингредиентов для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем меланжерным методом

Ингредиенты (в мл) Количество исследуемых сывороток
1 5 10 20 30
Флакон 1 (опыт)      
Антиген 0,15 0,75 1,5 3,0 4,5
Комплемент 0,15 0,75 1,5 3,0 4,5
Флакон 2 (контроль)      
Антиген 0,15 0,75 1,5 3,0 4,5
Инактивированная сыворотка крови морской свинки 0,15 0,75 1,5 3,0 4,5

Меланжеры промывают с помощью груши, насасывая в меланжер и удаляя из него дистиллированную воду 2 раза. Промывание проводят последовательно в 3 банках. Затем меланжеры складывают в стерилизатор и кипятят в течение 30 минут. Воду сливают, а меланжеры переносят в сушильный шкаф. После высушивания складывают в картонную коробку, заворачивают в бумагу и автоклавируют так же, как другую стеклянную посуду. После стерилизации вновь высушивают в сушильном шкафу и хранят в шкафу в боксе вместе с другой посудой не более 7 дней.

Основной опыт

Каждую сыворотку крови исследуют в двух меланжерах. В первый меланжер набирают исследуемую сыворотку крови до метки "I". С конца меланжера стерильным ватным тампоном снимают остатки сыворотки крови. После этого до метки "II" набирают смесь из первого флакона. Оба конца смесителя закрывают резиновым кольцом. Во второй меланжер набирают до метки "I" ту же самую сыворотку крови, а до отметки "II" смесь из второго флакона. После одевания кольца содержимое меланжеров перемешивают, меланжеры метят и укладывают в специальный штатив или коробку с вырезами. Штативы помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке меланжерного метода применяют те же контрольные исследования, которые используют при микроанаэростатном методе.

Оценка полученных результатов

Через 18-20 часов меланжеры вынимают из термостата попарно - опытный и контрольный - и содержимое переносят в заранее подготовленные и пронумерованные соответственно номерам меланжеров пробирки. Для этого после снятия кольца с меткой меланжер опускают в соответствующую пробирку. Содержимое меланжера либо свободно вытекает на дно пробирки, либо выталкивается из него при помощи резиновой части пипетки, надетой на верхний конец меланжеров. При ее помощи перемешивают находящуюся в пробирке жидкость и, не снимая пипетки с верхнего конца меланжера, нижним его концом наносят каплю жидкости из опытного меланжера на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону - каплю жидкости из контрольного меланжера. Стекла предварительно нумеруют соответственно номерам опытных меланжеров. Капли накрывают покровными стеклами, размером 20 x 20 мм. Регистрацию результатов и определение остаточного комплемента проводят так же, как при микроанаэростатном методе.

Источники ошибок те же, что и при применении микроанаэростатной методики реакции иммобилизации бледных трепонем.

Реакция иммунофлюоресценции для специфической серо- и ликвордиагностики сифилиса

Принцип метода заключается в соединении специфического комплекса антиген-антитело с иммунной антивидовой сывороткой, меченной флюорохромом, и выявление его с помощью люминесцентного микроскопа.

Методика постановки РИФ - АБС

Ингредиенты

Испытуемая сыворотка крови

Кровь для получения сыворотки крови берут из локтевой вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают также, как для постановки реакции Вассермана. Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56° в течение 30 минут. В связи с тем, что РИФ-абс ставится нестерильно, использование стерильной посуды и соблюдение условий стерильности при хранении сывороток крови не обязательно. Оно имеет значение только для более длительного сохранения сывороток крови до исследования.

Антиген

В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов-самцов с отрицательными результатами реакции Вассермана и РИТ заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из яичек бледные трепонемы так же, как в случае получения антигена для РИТ. Полученную взвесь бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными пробками и оставляют в холодильнике при 4° на сутки, после чего отделяют от осадка и при тех же условиях сохраняют весь период использования.

Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, т.к. с одним и тем же антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 месяцев. Для антигена следует выбирать ту взвесь, в которой не наблюдается агглютинация трепонем и имеется достаточное их количество. Антиген может быть получен в ампулах из других лабораторий. Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения для определения ее густоты. Для постановки РИФ-абс необходимо иметь взвесь, содержащую 40-60 трепонем в темном поле зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.

Сорбент

В качестве сорбента для РИФ-абс может быть использован ультраозвученный трепонемный антиген для РСК, выпускаемый Каунасским предприятием по производству бактерийных препаратов Минздрава СССР. Он представляет собой разрушенную ультразвуком взвесь смеси культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера. Каждая серия сорбента перед использованием в РИФ-абс с диагностической целью должна быть оттитрована.

Титрование сорбентов

Сорбенты титруют на сыворотках крови больных сифилисом, дающий в РИФ резко (4+) и слабо (2+) положительный результат в разведении 1 : 5, а также на сыворотках крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, дающих в РИФ-5 отрицательный результат и неспецифическую позитивность (2+ и более).

Пример определения титра сорбента

Цельный сорбент разводят фосфатным буфером, РН = 7,2, в 2, 3, 4 раза и более. Берут 3 сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5 резкоположительный (4+) результат, 2 - слабоположительный (2+), и 5 сывороток крови от людей, свободных от сифилитической инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты и РИФ-5 (2+ и более). Все сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным в свою очередь в 2, 3, 4 и более раз фосфатным буфером. Затем сыворотки крови исследуют в реакции. После учета результатов выбирают разведение сорбента, при котором сорбированные сыворотки крови больных сифилисом сохраняют степень позитивности, аналогичную полученной с сыворотками крови, разведенными фосфатным буфером, а сыворотки крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, не дают свечения. Это разведение сорбента является его титром.

Титром сорбента в данном случае явилось разведение 1 : 3, при котором все сыворотки крови больных сифилисом сохраняли степень позитивности, полученную в контроле, и в то же время надежно снималась неспецифическая позитивность несифилитических сывороток крови.

Антивидовая люминесцирующая сыворотка

Для исследования в РИФ-абс сывороток крови людей необходима меченная флюорохромом сыворотка крови животных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную люминесцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде в том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с резиновой пробкой и в процессе использования хранят при 4° в течение 1-2 месяцев.

В день постановки реакции нужное количество этой сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Указанное на этикетке рабочее разведение сыворотки не годится для постановки реакции с целью серодиагностики сифилиса, поэтому титр каждой серии необходимо определять заново.

Таблица N 13

Результаты титрования сорбента

Испытуемые сыворотки крови Результаты РИФ-5
Разведение сывороток крови 1 : 5 буфером (К) Разведение сывороток крови 1 : 5 сорбентом в разведении
1 : 2 1 : 3 1 : 4
Сыворотки крови больного сифилисом     
N 1 4+ 3+ 4+ 4+
N 2 2+ 1+ 2+ 2+
N 3 2+  2+ 2+
Несифилитическая сыворотка крови     
N 1 3+  1+ 2+
N 2 2/3+   2+
N 3 2+   2+
N 4 2+   2+
N 5     

Титрование антивидовой люминесцирующей сыворотки

Берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток крови здоровых людей, разводят их в 5 раз сорбентом (с учетом его титра) и ставят реакцию с использованием во II фазе различных разведений люминесцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Следует учесть, что титр люминесцирующих сывороток, выпускаемых в настоящее время ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, колеблется при постановке РИФ-абс от 1 : 100 до 1 : 140. При учете реакции предварительным титром люминесцирующей сыворотки следует считать то разведение, при использовании которого с положительными сыворотками крови получено хорошее свечение трепонем, а с отрицательными свечение антигена не получено. Большее разведение люминесцирующей сыворотки, чем титр, приводит к понижению чувствительности реакции, а меньшее - к снижению специфичности. После определения предварительного титра следует его уточнить на большем числе положительных и отрицательных сывороток крови. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 сыворотках крови, причем из них не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Для предотвращения пророста после разведения сухой люминесцирующей сыворотки дистиллированной водой к ней необходимо добавить мортиолат из расчета 1 объема его раствора 1 : 1000 к 9 объемам люминесцирующей сыворотки. При взятии новых ампул той же серии титр следует только проверить и уточнить на 10 заведомо положительных и отрицательных сывороток крови.

Пример определения предварительного титра люминесцирующей антивидовой сыворотки

Готовят 60 препаратов, нумеруют их от 1 до 60. Берут 10 сывороток крови - 5 от больных сифилисом, 5 от здоровых людей. Все сыворотки крови разводят в 5 раз разведенным но титру сорбентом.

На пронумерованные 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препараты наносят в I фазе реакции одни и те же 10 сывороток крови, разведенных в 5 раз сорбентом. Во II фазе реакции на 1-10 препараты наносят люминесцирующую сыворотку, разведенную 1 : 100, на 11-20 1 : 110, на 21-30 - 1 : 120, на 31-40 - 1 : 130, на 41-50 - 1 : 140, на 51-60 - 1 : 150.

Оптимальным следует считать разведение, при котором свечение антигена будет хорошим при постановке реакции с положительными сыворотками крови и не будет наблюдаться с отрицательными.

Техника постановки РИФ-абс

Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых стеклорезом обозначены кружки диаметром 0,7 см (по 10 кружков на 1 предметном стекле). В пределах кружка на стекло наносят антиген-взвесь бледных трепонем. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями взвесь распределяют в пределах кружка, высушивают на воздухе и фиксируют 10 минут в химически чистом ацетоне. Затем препараты нумеруют. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным по титру буферным раствором. В штатив помещают ряд пробирок, число и номер которых соответствует числу и номеру испытуемых сывороток крови. В пробирки пипеткой разливают разведенный по титру сорбент по 0,2 мл, затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки крови и хорошо перемешивают. Разведение сыворотки крови можно осуществлять аппаратом Флоринского. Разведенные сорбентом сыворотки крови наносят на антиген так, чтобы равномерно покрыть мазок, и препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и помещают на 30 минут в термостат при 37° (I фаза реакции). После первой фазы препараты осторожно промывают в 2 порциях фосфатного буфера, причем во вторую порцию препараты помещают на 10 минут, высушивают, после чего их вновь помещают во влажную камеру, наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (II фаза реакции). По окончании второй фазы препараты промывают фосфатным буфером, как описано выше, высушивают и наносят на поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла (диметилфталата).

Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе с ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250 с иммерсионной системой, окуляром 4Х или 5X, фильтрами СЗС-7 или 14, ФС-1. БС-8 и ЖС-18 или Т-2Н. Учет реакции осуществляется путем оценки свечения бледных трепонем. Положительными в РИФ-абс считают сыворотки крови, которые дают свечение на 4+, 3+ и 2+. Блестящее зелено-желтое свечение оценивается на 4+, яркое - 3+, слабое свечение2+. Отрицательными считают сыворотки крови, которые дают свечение на 1+ (трепонемы в препарате окрашены интенсивнее фона) или не дают его.

В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать следующие контроли:

Резкоположительный контроль. Сыворотка крови больного сифилисом, дающая свечение на 4+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении в 5 раз сорбентом сыворотка крови не должна терять степень позитивности более, чем на 1+.

Слабоположительный контроль. Цельная или разведенная сыворотка крови больного сифилисом, дающая слабую степень свечения антигена на 2+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении сорбентом позитивность ее должна сохраняться.

Неспецифический контроль. Несифилитическая сыворотка крови, дающая при разведении буфером флюоресценцию не менее 2+. При разведении сорбентом позитивность ее должна быть ликвидирована.

Контроли антигена, сорбента, люминесцирующей сыворотки могут ставиться только при использовании новых серий этих ингредиентов.

Методика постановки РИФ-абс с капиллярной кровью

Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и с кровью, взятой из пальца. Эту модификацию РИФ-абс можно использовать при обследовании на сифилис детей, при трудности получения крови из вены у взрослых, при массовом обследовании различных контингентов на сифилис.

При постановке РИФ-абс с кровью применяют те же ингредиенты реакции, что и при постановке РИФ-абс с сывороткой крови (антиген, сорбент, люминесцирующая сыворотка). Титр люминесцирующей сыворотки определяют по вышеизложенной схеме, но при постановке реакции с кровью. Кровь для исследования после прокола пальца пациента набирают микропипеткой до метки 0,1 мл, быстро выдувают в пробирку, содержащую 0,3 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой. Постановка реакции с разведенной кровью возможна как в день взятия ее, так и через 1-2 дня при условии хранения при 4°.

Непосредственно перед постановкой реакции ко всем образцам крови, включенным в постановку реакции, добавляют по 0,1 мл цельного сорбента, перемешивают пипеткой и встряхиванием, помещают на 30 минут в термостат при 37°. Затем кровь, обработанную сорбентом, наносят на мазки антигена и помещают ее во влажную камеру при 37° (1 фаза реакции). По истечении срока экспозиции препараты промывают в первой порции фосфатного буфера так, чтобы на стеклах не осталось следов крови и помещают их на 10 минут во вторую порцию буфера. После высушивания мазков проводят II фазу реакции. При этом на препараты наносят разведенную по титру, установленному для данной модификации РИФ, люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека. Стекла во влажной камере вновь помещают в термостат при 37°.

Через 30 минут препараты вновь промывают в 2 порциях фосфатного буфера в течение 10 минут, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Исследование препаратов и учет результатов реакции проводят так же, как при постановке РИФ-абс с сывороткой крови.

Методика постановки РИФ-200

Методика постановки РИФ-абс и РИФ-200 близки. При постановке РИФ-200 обработка испытуемых сывороток крови, приготовление антигена, подготовка антивидовой люминесцирующей сыворотки и ее титрование производят так же, как при постановке РИФ-абс. Следует учесть только, что титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1 : 20 до 1 : 50.

Техника постановки РИФ-200

Испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз фосфатным буфером. Для этого в штатив помещают 3 ряда пробирок, число и нумерация которых в каждом ряду соответствует числу и нумерации испытуемых сывороток крови в рабочем журнале. В первом ряду налиты цельные испытуемые сыворотки крови, во втором ряду в пробирки наливают по 0,45 мл буфера, в третьем - по 0,95 мл буфера. Во втором ряду готовят разведение сывороток крови в 10 раз, для чего из каждой пробирки первого ряда отдельной 1 мл градуированной пипеткой берут 0,05 мл испытуемой сыворотки крови, переносят в соответствующую пробирку второго ряда и смешивают с имеющимся там буфером. Из каждой пробирки второго ряда той же самой пипеткой переносят по 0,05 мл разведенной уже в 10 раз испытуемой сыворотки крови в соответствующую пробирку третьего ряда и получают разведение в 200 раз.

При постановке реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят разведенные в 200 раз испытуемые сыворотки крови так, чтобы их номера, обозначенные на пробирках, соответствовали номерам на предметных стеклах. После нанесения на препараты сыворотки крови влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с температурой 37° (I фаза реакции). Затем препараты промывают 10 минут в 2 порциях буфера и высушивают. После этого их вновь помещают во влажную камеру и на все наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку (II фаза реакции). Вторую фазу проводят 30 минут при комнатной температуре, после чего препараты 10 минут промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.

Учет результатов РИФ-200 производят так же, как и РИФ-абс.

В том случае, когда клиницистов интересует титр флюоресцирующих антител в сыворотке крови больного, РИФ-абс и РИФ-200 следует ставить с последовательным разведением испытуемых сывороток крови и титром флюоресцирующих антител считать то наибольшее разведение сыворотки крови, которое еще дает положительный результат реакции. Обозначать титр принято числом, характеризующим степень разведения испытуемой сыворотки крови, например, 5, 10, 20, 40 и т.д. (РИФ-абс) или 200, 400, 800 и т.д. (РИФ-200).

При постановке обеих модификаций реакции для разведения испытуемых сывороток крови и для промывания препаратов после I и II фаз следует использовать фотфатный буфер следующего состава: 1 л дистиллированной воды, 6,8 г натрия хлорида, 1,48 г двузамещенного фосфорно-кислого натрия, 0,43 г однозамещенного фосфорнокислого калия (РН = 7,2). Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более недели.

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при наличии флюоресцирующих антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения больных пенициллином.

Методика постановки РИФ-ц

Ранняя диагностика поражений нервной системы при сифилисе является актуальным вопросом в деле борьбы с этим заболеванием. В связи с тем, что РИФ-ц обладает большей чувствительностью, чем все другие используемые для ликвордиагностики сифилиса тесты, эта модификация РИФ может быть рекомендована для диагностики сифилитических поражений центральной нервной системы при всех формах сифилиса.

Для постановки РИФ-ц используют тот же антиген, люминесцирующую сыворотку, что и для постановки РИФ-абс и РИФ-200 с сывороткой крови. Аналогичны также определение флюоресцирующих антител в ликворе и сыворотке крови и учет реакции.

Спинномозговая жидкость вводится в реакцию неинактивированной и цельной. До постановки реакции ее можно сохранять в морозильном отделении холодильника в пробирках под резиновыми пробками до 2 недель. Оттаивание производят при комнатной температуре.

Техника постановки РИФ-ц

В I фазе реакции на антиген наносят 0,05 мл неразведенной испытуемой спинномозговой жидкости, препараты помещают во влажную камеру на 30 минут при комнатной температуре. Затем их промывают фосфатным буфером, РН = 7,2, в течение 10 минут, высушивают. Во II фазе на препараты наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку, которую титруют при постановке реакции со спинномозговой жидкостью. Выдерживают препараты при комнатной температуре 30 минут во влажной камере, промывают, высушивают, монтируют для люминесцентной микроскопии.

Источники ошибок

1. Несоблюдение условий приготовления, хранения реагентов и постановки реакции.

2. Низкое качество люминесцирующей сыворотки и неточное определение ее титра.

3. Нанесение исследуемого материала или люминесцирующей сыворотки при постановке реакции не на препарат, а на другую сторону предметного стекла.

4. Неправильная установка освещения в люминесцентном микроскопе.

5. Низкое качество антигена.

Правила работы в серологических лабораториях

Устройство и содержание помещений

Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, желательно горячим водоснабжением, канализацией, центральным водяным отоплением и газом (если в населенном пункте есть газовая сеть). В населенных пунктах, не имеющих водопровода и канализации, желательно устройство местного водопровода, канализации и очистных сооружений.

В производственных помещениях лабораторий должны быть оборудованы две водопроводные раковины, одна - для мытья рук персонала, другая - для мытья лабораторного инвентаря и посуды.

Аппараты, приборы, оборудование

Электроприборы (центрифуги, сушильные шкафы, термостаты, водяные бани, автоклавы) должны быть заземлены.

При работе с микроскопом необходимо обеспечивать правильное освещение поля зрения, рекомендуется использовать бинокуляр, а если его нет, то не закрывать неработающий глаз, работать попеременно то одним, то другим глазом, делать перерывы в работе при переутомлении зрения.

При работе с вращающимися устройствами соблюдать правила, обеспечивающие безопасность обслуживающего персонала, а именно:

- центрифуги включать только после закрытия крышки,

- пробирки вынимать только после полной остановки ротора.

- волосы работающего должны быть подобраны под косынку или шапочку.

Работа с инфицированным материалом

Для получения инфицированного материала от животных должны быть специальный стол с набором инструментов, которые должны употребляться только для этих целей.

Боксы, в которых производится работа с бледными трепонемами, должны иметь следующее оборудование:

- шкаф для посуды и инструментов,

- стол, покрытый линолеумом,

- банки с дезраствором,

- эмалированную посуду с крышками для использованной инфицированной посуды и отработанного материала,

- бактерицидные лампы для стерилизации воздуха и оборудования.

За пределы данного учреждения инфицированный материал выносят в пробирках, флаконах и пр., завернутых в гигроскопическую вату и помещенных в металлический сосуд с плотно закрывающейся крышкой.

Боксы, в которых производится работа с зараженными животными, должны иметь следующее оборудование:

- шкаф для посуды и инструментов,

- стол, покрытый линолеумом,

- деревянные станки для фиксации животных, которые должны быть окрашены светлой масляной или нитрокраской,

- бактерицидная лампа.

Оперативные вмешательства на зараженных животных и заражение должны производиться в фартуке, резиновых перчатках и защитных очках. После работы фартук и перчатки обрабатывают дезинфицирующим раствором, перчатки кипятят в течение 30 минут.

Тушки убитых животных, больных сифилисом, необходимо собирать в специальное хранилище с последующим сжиганием. При невозможности сжигания, тушки заливают 5% раствором хлорамина на сутки, а затем закапывают в землю вдали от жилых помещений на достаточную глубину (0,7-1 метр), не допускающую выкапывания их другими животными (крысами, собаками, кошками и т.п.).

В процессе работы и после ее окончания применяют следующие способы дезинфекции. Посуду, соприкасающуюся с бледными трепонемами или содержащую кусочки зараженных тканей, погружают в мыльную воду комнатной температуры без применения дезинфицирующих средств, кипятят в течение 30 минут в указанном растворе, охлаждают и моют водопроводной, сначала теплой, затем холодной водой, с последующим прополаскиванием дистиллированной водой.

Просвет верхнего конца пипетки, с помощью которой насасывают инфицированный материал, должен быть плотно закрыт ватным тампоном.

Пипетки, загрязненные бледными трепонемами, помещают в 3-5% раствор карболовой кислоты на 1 час, затем промывают 5-6 раз водопроводной водой и один раз - дистиллированной. Если пипетки при этом не становятся прозрачными, их погружают в раствор хромовой смеси на сутки, после чего промывают 9 раз водопроводной водой и один раз дистиллированной.

Поступившую на исследование кровь и полученную из нее сыворотку крови после работы сливают в канализационную сеть, предварительно обработав дезинфицирующим средством.

Посуду после использования промывают под проточной водой, затем замачивают в горячем (50°) моющем растворе на 30 минут, полностью погружая ее в раствор и заполняя полости. Затем посуду моют ершами или ватно-марлевыми тампонами, в среднем 25-30 секунд один предмет. Вымытую посуду прополаскивают в проточной воде, затем в дистиллированной и высушивают при температуре 180-200° в течение 45 минут.

В качестве моющего раствора применяют 0,5% комплекс перекиси водорода с моющими средствами - новость, прогресс, сульфанол, триас-4, лотос, астра и др. (33 раствор пергидроля - 20 мл + 975 мл воды + 5 г моющего средства).

Мокрые пробирки складывают в специальные ящики, на дне которых имеются отверстия, через которые стекает оставшаяся после мытья в пробирках вода. При большом числе пробирок мыть их удобно с помощью приспособления к водопроводному крану, а также ершами, предложенными А.В.Флоринским.

Поверхность рабочих столов в конце каждого рабочего дня, а также при загрязнении их кровью, сывороткой крови обрабатывают дезинфицирующим раствором (80 мл 96° спирта + 20 мл дистиллированной воды + 7 мл 33% пергидроля; раствором сулемы 1 : 1000 и др.).

В случае загрязнения рук кровью их следует вымыть теплой водой с хозяйственным мылом, насухо вытереть и обработать тампоном, смоченным антисептиком (6% раствором перекиси водорода, 0,1% раствором дезоксана или 70% раствором этилового спирта).

Все манипуляции, при которых может произойти загрязнение рук кровью и сывороткой крови, следует проводить в резиновых перчатках.

При работе с кровью, сывороткой крови нужно пользоваться резиновой грушей. Насасывание ртом не допускается.

Мероприятия в случае аварии

При аварии во время работы с инфекционным материалом (бой посуды, разбрызгивание из шприца при заражении животных, а также во всех случаях, ведущих к загрязнению заразным материалом окружающих предметов, одежды и открытых частей тела работников) присутствующий при этом персонал обязан немедленно известить о случившемся заведующего лабораторией и провести обеззараживание помещения, оборудования и предметов, которые могли быть инфицированы, а также провести самообеззараживание.

Для ликвидации последствий аварии применяют следующие методы обеззараживания:

- горизонтальную поверхность, на которую попал заразный материал, заливают дезинфицирующим раствором (5% раствором хлорамина или 5% раствором карболовой кислоты);

- вертикальные поверхности (загрязненные стены, поверхность мебели, приборов) протирают ватными или марлевыми тампонами, обильно смоченными дезинфицирующим раствором;

- загрязненную одежду снимают и замачивают в дезинфицирующем растворе;

- загрязненную обувь обмывают тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором;

- открытые участки кожи лица, рук и других частей тела в случае загрязнения их заразным материалом (взвесь бледных трепонем, сыворотка крови из инфекционного отделения) обрабатывают 70% этиловым спиртом;

- при загрязнении слизистых оболочек рот прополаскивают 5% раствором соды или 0,5% раствором соляной кислоты, глаза промывают водой и закапывают свежеприготовленный 1% раствор азотнокислого серебра или 30% альбуцида; в нос закапывают 1-2 капли 1% раствора протаргола. Проводят профилактическое лечение;

- при несчастном случае, связанном с ранением или укусом зараженным животным или другими нарушениями целостности кожных покровов, необходимо выдавить из ранки кровь, смазать рану 5% настойкой йода и провести курс профилактического лечения. При оцарапывании кожи зараженным животным на место ранения кладут на 5 минут компресс с 5% раствором лизола или делают ванночку из того же раствора.

Порядок выдачи зараженных сифилисом кроликов или взвеси бледных трепонем

Разрешение на выдачу зараженных сифилисом кроликов дает Главное управление карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР, поэтому для получения зараженного животного необходимо предварительно обратиться за разрешением к заместителю начальника Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР, председателю центральной режимной комиссии.

Выдача зараженных сифилисом кроликов, а также взвеси бледных трепонем, производится в соответствии с "Положением о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", утвержденным Министерством здравоохранения СССР 18.V.1979 г., через нарочного по предъявлении им официального требования за подписью руководителя учреждения, скрепленной гербовой печатью, доверенности и паспорта.

Учреждение, получившее зараженного сифилисом животного или взвесь бледных трепонем, должно уведомить об этом письменно учреждение, выдавшее животного или взвесь.

В случае возникновения при перевозках культур аварий или катастроф, а также утрат или хищений их, необходимо немедленно сообщить об этом в местные органы санитарно-эпидемиологической службы для принятия мер по охране места происшествия, ликвидации последствий аварии, организации розыска похищенного или потерянного.

Настоящая инструкция составлена сотрудниками Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Министерства здравоохранения СССР заслуженным деятелем науки, профессором Н.М. Овчинниковым, профессором В.Н. Бедновой, доктором биологических наук Л.С.Резниковой, кандидатами медицинских наук О.А. Стояновой, Т.И. Милоновой, Э.А. Орлиной.

Начальник Главного управления
лечебно-профилактической помощи
А.М. МОСКВИЧЕВ